[摘要] 目的 探讨结肠癌患者应用直接测序法测定K-ras基因的灵敏度及其临床价值。 方法 选取我院2016年2月～2017年4月收治的结肠癌患者80例，随机分为研究组和对照组两组，研究组患者通过直接测序法、对照组患者通过sanger测序法检测患者体内的K-ras基因突变情况，分析K-ras基因突变率与患者肿瘤大小、肿瘤部位、患者年龄等一般资料之间的相关性。 结果 研究组患者测定K-ras基因突变的灵敏度明显高于对照组（P<0.05），肿瘤直径在5 cm以上患者的K-ras基因突变率明显低于直径在5 cm以下的患者（P<0.05），研究组检出率与患者肿瘤部位及分化程度、患者年龄等存在相关性。 结论 应用直接测序法检测结肠癌患者 K-ras基因的突变情况具有较高的灵敏度，直接测序法的检出率与患者的肿瘤大小、肿瘤分化程度以及患者的年龄等存在较强的相关性，对于临床上结肠癌等恶性肿瘤疾病的诊断具有较强的应用价值，值得临床上广泛推荐使用。
[关键词] 结肠癌；直接测序法；K-ras基因；灵敏度；临床价值
[中图分类号] R446.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）16-0128-04
Sensitivity and clinical value of direct sequencing in the detection of K-ras gene in colon cancer patients
YANG Lijun SUN Qian WAN Xiaochen
Department of Clinical Laboratory， Zhejiang Hospital， Hangzhou 310013， China
[Abstract] Objective To analyze the sensitivity and clinical value of direct sequencing in the detection of K-ras gene in colon cancer patients. Methods 80 colon cancer patients from February 2016 to April 2017 in our hospital were randomLy divided into the study group and the control group. The K-ras gene mutations in the study group were detected by direct sequencing and those in the control group were detected by sanger sequencing. The correlation of the K-ras gene mutation rate with the patient"s general data including tumor size， tumor location and age was analyzed. Results The sensitivity of the K-ras gene mutation detection in the study group was significantly higher than that in the control group（P<0.05）. The K-ras gene mutation rate was significantly lower in patients with tumor diameters above 5 cm than that in patients with diameters below 5 cm（P<0.05）. The detection rate of the study group is related to the location and differentiation of the patient"s tumor and the age of the patient. Conclusion The direct sequencing method in the detection of the mutation of K-ras gene in patients with colon cancer has high sensitivity.The detection rate of direct sequencing is strongly correlated with the patient"s tumor size， tumor differentiation，and the patient"s age.The method has strong application value for the clinical diagnosis of malignant diseases such as colon cancer，and it is worth recommending.
[Key words] Colon cancer； Direct sequencing； K-ras gene； Sensitivity； Clinical value
相關研究结果表明，随着社会的发展及人们生活水平的改变，结肠癌的发生率呈现不断上升的趋势，严重威胁患者的生命健康安全，有研究表明此类疾病的发生涉及分子水平的改变，即相关原癌、抑癌基因的改变，K-ras基因属于ras家族的成员之一，结肠癌的发生常常伴随其突变，随着人类基因组计划的完成，后基因组时代的相关技术极大程度的应用于临床，对此我院应用直接测序法并测定其在检测结肠癌患者体内的K-ras基因时的灵敏度及其检查结果与患者疾病发生情况之间的关系，取得了理想的效果，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取我院2016年2月～2017年4月收治的结肠癌患者80例，随机分为研究组和对照组两组各40例，纳入标准：（1）患者经病理学检查方法确诊为结肠癌患者；（2）自愿接受本次研究的全部过程；（3）未接受过结肠切除手术，为初次发病患者[1]。排除标准：（1）兼有癫痫等精神类疾病不能积极配合者；（2）存在其他恶性肿瘤者；（3）伴有严重肝肾功能障碍者；（4）伴有严重心肺功能障碍的患者；其中研究组患者40例，男19例，女21例，年龄30～65岁，平均（46.7±2.1）岁，病程2～10个月，平均（6.3±1.5）个月，对照组患者40例，男20例，女20例，年龄31～66岁，平均（48.2±2.1）岁，病程2～12个月，平均病程（8.2±2.3）个月，两组患者的年龄、性别差异无统计学统计学意义（P>0.05），肿瘤分化程度等差异存在统计学意义（P<0.05），两组患者均知情本次研究的全部过程并签署知情同意书，实验过程经本院伦理协会批准。
1.2 方法
基因组DNA的提取方法：第一，通过手术等方式切取3片病变组织，厚度为9 μm左右，切取后平铺于洁净的载玻片上，随后用二甲苯进行脱蜡处理。第二，选用无菌刀片将肿瘤组织进行刮片处理并保存至2 mL左右的离心管中并加入1 mL二甲苯，充分混合后离心取上清，离心时间为120 s，将上清与1 mL無水乙醇充分混合后再离心，离心时间相同，离心结束分离沉淀并将上清置于室温静置以使酒精充分挥发[2]。向静置后的血清中分别加入裂解液和蛋白酶K，用量分别为：181 μL左右、21 μL左右，混合均匀后55℃水浴60 min以使样本彻底裂解，若60 min内未裂解可持续进行温水浴但时间不可超过2 d[3]。第三，裂解完成后于90℃条件下水浴60 min并立即进行离心，去除管盖中累计的液体，重新向标本中加入裂解液 、无水乙醇，二者用量均为201 μL左右，混合均匀后立即离心并取0.6 mL的裂解产物置于抽提柱内，更换提取柱所在的收集管[4]。重新加入0.5 mL裂解液，离心时间60 s后更换收集管，再次加入裂解液并离心，操作方法与用量与上步完全相同，随后对样品进行全速离心，去除杂质并更换提取柱的离心管，向靠近提取柱内膜的中心添加洗脱液并在室温条件下放置60 s即完成试样的提取。样品的保存方法为：4℃保存24 h，-20℃下>1 d[5]。
1.2.1 研究组 患者K-ras基因测定方法。研究组患者采用直接测序法测定K-ras基因的突变状况，根据结肠癌患者中K-ras基因的cDNA序列及其12、13位密码子改变引起的7个突变的基因序列进行引物的设计，随后分别在95℃下扩增6 min左右，同温扩增7/12 min，温度降低40℃后扩增45 s，温度升至71℃后扩增1.5 min，循坏次数为35次，保存条件为4℃冷藏[6]。将扩增后的产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳处理，电泳参数为120 V，25 min[7]。将335 bp左右处的克隆条带及其胶体回收，将得到的特异性扩增产物送至专门公司进行测序[8]。基因的突变荧光PCR检测试剂盒，反应分为三个阶段：（1）95℃的条件下300 s；（2）与上述相同的温度25 s后在65℃的条件下处理20 s，温度为73℃下处理20 s，循环次数为15次；（3）在温度为92℃、41℃、73℃的条件下分别处理25、35、20 s，循环次数为32个左右。在第三阶段的中间循坏处收集FAM和VIC信号，样品阳性或阴性的判断标准为突变发生的Ct值大小[9]。
1.2.2 对照组 患者K-ras基因测定方法。对照组患者采用sanger测序法测定K-ras基因的突变状况，具体为：向反应体系中加入7种K-ra，方法同1.2.1研究组患者K-ras基因测定方法[10]。研究组患者采用直接测序法测定K-ras基因的突变状况，根据结肠癌患者中K-ras基因的cDNA序列及其12.13位密码子改变引起的7个突变的基因序列进行引物的设计，随后分别在95℃下扩增6 min左右，同温扩增7/12 min，温度降低40℃后扩增45 s，温度升至71℃后扩增1.5 min，循坏次数为35次，保存条件为4℃冷藏[11]。将扩增后的产物在琼脂糖凝胶电泳中电泳处理，电泳参数为120 V，25 min。将335 bp左右处的克隆条带及其胶体回收，将得到的特异性扩增产物送至专门公司进行测序[12]。
1.3 观察指标
（1）对比两组研究方法的检测灵敏度，灵敏度为真阳性/（真阳性+假阴性）。（2）对比不同组研究方法肿瘤大小与基因突变率之间的关系。（3）对比患者的肿瘤部位、患者年龄以及肿瘤分化程度与基因突变之间的关系[13]。
1.4 统计学方法
使用统计学软件SPSS19.0分析，计量资料采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组研究方法灵敏度比较
研究组检测方法的基因突变检出灵敏度明显高于对照组患者（P<0.05）。
2.2 两组检测结果与肿瘤大小之间的相关性比较
对于直径<5 cm的肿瘤，两组突变例数检出率无显著差异，对于直径≥5 cm的肿瘤，研究组检出率显出高于对照组（P<0.05）。
2.3 患者一般资料与直接测序法检测结果之间的相关性比较
直接测序法测得结果与患者的肿瘤分化程度，肿瘤部位、患者年龄之间呈明显正相关关系（P<0.05）。
3 讨论
随着社会的发展以及人们生活水平的提高，结肠癌的疾病发生率呈现不断上升的趋势，统计结果显示，此类疾病的发生率呈现不断上升的趋势，疾病的发生常常伴随基因突变等分子水平的改变，越来越多的研究者开始在分子水平进行探究以采取合理的措施从根本上采取针对性的疾病治疗措施[14]。K-ras是ras家族的重要成员，结肠癌的发生常常伴随此类基因的突变，对此我院通过直接测序法检测此类基因的突变情况判断患者的疾病发生情况[15]。本次研究结果表明，随着患者年龄的增加以及肿瘤分化程度的升高，患者体内的基因突变率呈现不断上升的趋势（P<0.05），说明直接测序法所测得的基因突变率的测定结果与患者的疾病发生情况之间存在较强的相关性，将直接测序法应用于疾病的诊断具有较强的可行性[16]。
人类基因组计划的圆满完成促进了后基因组时代的发展，基因组的测序以及检测工序不断应用于临床，但检测方法的准确性以及灵敏度地区差异较大，极大程度的增加了临床靶向治疗的不确定性，直接测序法基因测序技术是转化医学研究遗传物质过程中重要的技术之一[17]。研究表明通过直接测序法检测患者体内K-ras基因的突变情况能够一定程度的反应患者的疾病发生情况，此类基因广泛存在于人类的各类器官组织，參与重要的表皮生长因子的基因表达过程，与细胞分化过程密切相关[18]。本次研究结果表明，随着患者肿瘤的不断分化，患者的基因突变率呈现不断上升的趋势，说明通过直接测序法进行基因突变状况的检测准确性较高[19]。
相关研究结果表明，K-ras基因的主要作用机制为：借助Ras-Raf-MAPK信号通路控制细胞的增值以及分化过程，但其在正常发挥作用的过程中为调节性控制而非持续性，ras与GTP集合后才具活性，因此能够受GTP酶的控制而失活，若GTP持续与RAS结合则引起信号通路的持续性兴奋，生长信号不断得到传播并在传播过程中不断放大，最终导致细胞的持续不间断增殖，恶性肿瘤形成。只有做到疾病的早发现才能及时采取针对性的措施进行早期疾病的治疗。本次研究结果表明，研究组检测的灵敏度明显高于对照组（P<0.05），说明直接测序法的使用能够明显提高基因检测的灵敏度，提高疾病的检出效率[20]。
综上所述，应用直接测序法检测结肠癌患者K-ras基因的突变情况具有较高的灵敏度，直接测序法的检出率与患者的肿瘤大小、肿瘤分化程度以及患者的年龄等存在较强的相关性，对于临床上结肠癌等恶性肿瘤疾病的诊断具较强的应用价值，值得临床上广泛推荐使用。
[参考文献]
[1]李艳艳，高静，杨蕊，等.结直肠癌Ras、BRAF和PIK3CA基因突变分析及与临床病理特征的关系[J].临床肿瘤学杂志，2016，21（1）：27-33.
[2]王晓光，陈飞，亓立峰，等.新型纳米捕获探针检测血浆中K-ras基因突变在胰腺癌诊断及预后中的价值[J].中华胰腺病杂志，2016，16（3）：170-174.
[3]汪俊，谭斌，杨海春，等.结直肠癌K-ras基因突变两种检测方法的比较及临床相关性分析[J].哈尔滨医科大学学报，2015，49（3）：232-235.
[4]Kim SY，Choi EJ，Yun JA，et al. Syndecan-1 expression is associated with tumor size and EGFR expression in colorectal carcinoma：A clinicopathological study of 230 cases[J]. International Journal of Medical Sciences，2015， 12（2）：92-99.
[5]王倩，顾页，林洁.高分辨率熔解曲线分析法检测结直肠癌组织K-ras基因突变及其临床意义[J].医学研究生学报，2015，4（8）：840-842.
[6]王杰，衣素琴，王欢，等.非小细胞肺癌中c-Met、EGFR、K-Ras和EML4-ALK基因的检测分析[J].临床肿瘤学杂志，2015，12（10）：902-908.
[7]曾照志，郭威，刘明标.CT诊断结肠癌的临床价值探讨[J].中国现代医生，2017，55（20）：112-114.
[8]潘丹丽.超声造影用于结肠癌术前分期的临床价值分析[J].中国现代医生，2017，55（14）：103-105.
[9]吕矫洁，孔蕴毅，蔡旭，等.BRAF V600E抗体在检测恶性黑色素瘤BRAF V600E基因突变中的应用价值[J].中华病理学杂志，2017，46（8）：548-552.
[10]鞠红艳，白洋，王策，等.转化生长因子β激活酶1在结肠癌中的表达及临床意义[J].中国普通外科杂志，2015， 24（10）：1417-1421.
[11]王珏，张婷婷，李娟，等.不同原发肿瘤位置对于西妥昔单抗联合化疗治疗K-ras基因野生型的转移性结直肠癌患者的预后比较[J].现代生物医学进展，2016，16（6）：1153-1155.
[12]蓝晓红，周永刚.西妥昔单抗致横纹肌溶解及严重超敏反应1例[J].中国药师，2015，8（2）：285-286.
[13]Bencsikova B，Bortlicek Z，Halamkova J，et al. Efficacy of bevacizumab and chemotherapy in the first-line treatment of metastatic colorectal cancer：Broadening KRAS-focused clinical view[J]. Bmc Gastroenterology，2015，15（1）：37-39.
[14]宋业颖，许春伟，吴永芳，等.非小细胞肺癌患者肿瘤组织中EGFR、K-Ras和BRAF基因突变的分子病理检测分析[J].解放军医药杂志，2015，36（4）：1658-1664.
[15]王建华，李纪鹏，金明威，等.Sanger测序法和突变扩增阻滞系统法检测非小细胞肺癌EGFR基因19、21号外显子突变的临床价值比较[J].浙江医学，2017，39（2）：97-101.
[16]张凯，顾滕振.结直肠癌组织K-ras、BRAF及PIK3CA基因突变的检测及其与临床病理特征的关系[J].广西医科大学学报，2016，33（2）：299-301.
[17]崔飞博，陈南征，郑见宝，等.结直肠癌组织中EGFR、BRAF和K-RasK-Ras基因的表达及其临床意义[J].中国普外基础与临床杂志，2016，9（5）：556-560.
[18]Ishida T，Ishii Y，Tsuruta M，et al. Cetuximab promotes SN38 sensitivity via suppression of heat shock protein 27 in colorectal cancer cells with wild-type RAS[J].Oncology Reports，2017，38（2）：90-91.
[19]宋红林.血清糖链抗原、粘附分子及K-ras基因突变水平在胰腺癌中的表达及其临床意义[J].实用癌症杂志，2017，32（7）：1105-1109.
[20]秦海霞，崔红凯，潘莹，等.miR-143通过靶向调控K-ras基因的表达抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖[J].中华肿瘤杂志，2016，38（12）：893-897.
[21]练英妮，毛进星，曾志坚，等.XELOX和OLF化疗方案治疗基因突变型老年晚期大肠癌的疗效分析[J].中国现代医学杂志，2016，21（2）：51-54.
（收稿日期：2018-02-02）